Belinostat (PXD101)

Subconfluente culturen worden geoogst en tweemaal gewassen in ijskoud PBS en gepelleteerd door centrifugatie bij 200 × g gedurende 5 min. De celpellet wordt opnieuw gesuspendeerd in twee volumes lysisbuffer [60 mM Tris-buffer (pH 7.4) met 30% glycerol en 450 mM NaCl] en gelyseerd door drie vries (droogijs) ontdooi (30 °C waterbad) cycli. Celdebris wordt verwijderd door centrifugatie bij 1,2 × 10⁴ g gedurende 5 min, en het supernatant wordt opgeslagen bij −80 °C. Histon H4-peptide (sequentie SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK overeenkomend met de 20 NH2-terminale residuen) wordt geacetyleerd door een recombinant eiwit dat het hypoxanthine-aminopterine-thymidine-domein van p300 bevat, met behulp van [³H]acetyl CoA als acetaatbron. H4-peptide (100 μg) wordt gemengd met hypoxanthine-aminopterine-thymidine-buffer (50 mM Tris HCl pH 8.0, 5% glycerol, 50 mM KCl en 0.1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-aminoethyl)benzeensulfonylfluoride, 1 × complete protease-remmers, 50 μL gezuiverd p300 en 1.85 m [³H]acetyl CoA (4.50Ci/mmol) in een eindvolume van 300 μL en geïncubeerd bij 30 °C gedurende 45 min. Het p300-eiwit wordt verwijderd door incubatie met 20 μL van 50% Ni-agaroase beads gedurende 1 uur bij 4 °C en centrifugatie. Het supernatant wordt aangebracht op een 2 mL Sephadex G15-kolom, en de doorstroom wordt opgevangen. Eén milliliter gedestilleerd H₂O wordt voorzichtig aangebracht, en drie druppelfracties worden opgevangen; dit wordt herhaald totdat 4–5 mL gedestilleerd H₂O is toegevoegd, en ~40 fracties worden opgevangen. Drie microliter van elke fractie wordt verdund in 2 mL scintillatievloeistof en geteld in een scintillatieteller om de fracties te identificeren die het gelabelde peptide bevatten. Deze fracties worden samengevoegd, en 1 μL van het gecombineerde monster wordt gemeten om de radioactiviteit in elke peptidebatch te beoordelen (3-7×10³ cpm/μL). Voor activiteitsassays wordt de reactie uitgevoerd in een totaal volume van 150 μL buffer [60 mM Tris (pH 7.4) met 30% glycerol] met 2 μL celextract en, indien gebruikt, 2 μL van deze verbinding. De reactie wordt gestart door de toevoeging van 2 μL [³H] gelabeld substraat (geacetyleerd histon H4-peptide overeenkomend met de 20 NH₂-terminale residuen). Monsters worden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 45 min, en de reactie wordt gestopt door de toevoeging van HCl en azijnzuur (respectievelijk 0.72 en 0.12 M eindconcentraties). Vrijgekomen [³H]acetaat wordt geëxtraheerd in 750 μL ethylacetaat, en monsters worden gecentrifugeerd bij 1.2 × 10⁴ g gedurende 5 min. De bovenste fase (600 μL) wordt overgebracht naar 3 mL scintillatievloeistof en geteld.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.