AZD7762

AZD7762, een meer selectieve Chk1-remmer, remt de Chk1-fosforylering van een cdc25C-peptide door reversibel te binden aan de ATP-bindingsplaats van Chk1, met een IC50 van 5 nM en een K_i van 3,6 nM. Deze verbinding induceert celstop met een EC50 van 0,620 μM, en heft de door camptothecine geïnduceerde G2-arrest significant op met een EC50 van 10 nM, door de Chk1-afhankelijke afbraak van Cdc25A en de activering van Cyclin A te blokkeren. Het (300 nM) verbetert de antitumorale werkzaamheid tegen SW620 en tegen MDA-MB-231 door de GI50-waarden te verlagen van respectievelijk 24,1 nM en 2,25 μM naar 1,08 nM en 0,15 μM. [1] Dit chemische middel vertoont cytotoxiciteit tegen een verscheidenheid aan neuroblastoom-cellijnen met p53 wild type, p53-mutatie, Mdm2-amplificatie of p14-deletie met IC50-waarden variërend van 82,6-505,9 nM. [2]

AZD7762 alleen bij 25 mg/kg vertoont weinig antitumorale activiteit bij de H460-DNp53 xenograftmuizen en SW620 xenograftmuizen, maar wanneer het in combinatie wordt toegediend, vertoont deze verbinding een significante antitumorale werkzaamheid bij de twee xenograftmuizen met een log celvernietiging van 0,9 of een behandeld/controlepercentage (%T/C) van 26, zelfs bij een lage dosis van 12,5 mg. De toediening van deze chemische stof in combinatie bij de H460-DNp53 xenograftrat remt het tumorvolume op een dosisafhankelijke manier met %T/C-waarden van 48 en 32 voor respectievelijk 10 en 20 mg/kg. Deze verbinding (25 mg/kg) in combinatie veroorzaakt volledige tumorregressie bij de SW620 xenograftmuizen, waarbij de %T/C significant toeneemt tot respectievelijk -66% en -67%. [1]

• Chk1 Kinase Test

  Recombinant humaan Chk1 wordt tot expressie gebracht als een S-transferase fusie in insectencellen met behulp van een baculovirus vector en gezuiverd door affiniteitschromatografie. Een synthetisch peptidesubstraat (N-biotinylaminohexanoyl-KKVSRSGLYRSPMPENLNRPR) voor Chk1 wordt gesynthetiseerd. De uiteindelijke testconcentraties van peptide en ATP (koud + 40 nCi [³³P]ATP) zijn respectievelijk 0,8 en 1 μM. Verschillende concentraties van deze verbinding, buffer die peptide en Chk1 kinase en ATP bevat, worden achtereenvolgens toegevoegd aan een 384-wells testplaat. De plaat wordt 2 uur geïncubeerd, de reactie wordt gestopt door toevoeging van buffer die EDTA en scintillatieproximiteitsassay-kralen bevat, en de platen worden afgelezen met behulp van een TopCount-lezer. Gegevensanalyse wordt uitgevoerd om een dosisrespons (IC50) te bepalen.

• Cellijnen

  HT29, SW620 and MDA-MB-231 cells

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentration ~12.5 μM

• Incubatietijd

  20 or 48 hours

• Methode

  For the checkpoint abrogation assay, HT29 cells are treated for 2 hours with camptothecin (topoisomerase I inhibitor; 0.07 μg/mL) to induce the G2 checkpoint. Cells are then treated for 20 hours with a 12-point titration of AZD7762 (12.5 μM to 6 nM) plus nocodazole. Cells are fixed with 3.7% formaldehyde for 1 hour, permeabilized with PBS containing 0.05% Triton X, and incubated with anti-phH3 antibody for 1 hour followed by Alexa Fluor 488 anti-rabbit and Hoechst stain for 1 hour. Mitotic index is determined on the ArrayScan and expressed as the percentage of cells undergoing mitosis. For the potentiation assays, SW620 or MDA-MB-231 cells are dosed for 24 hours with a 9-point titration of ranging from 0.01 to 100 nM with a constant dose of this compound (300 nM). After 24 hours, medium is removed and this chemical alone is added back to the wells for an additional 24 hours. Cells are then incubated in this compound-free medium for an additional 72 hours. The effect on cell proliferation is determined by MTT.

• Dierlijke modellen

  Male NCr mice implanted s.c. with H460-DNp53 cells or SW620, and male rnu rats implanted s.c. with H460-DNp53 cells

• Doseringen

  ~25 mg/kg

• Toediening

  Injection i.v.