AG-14361

AG14361 is minstens 1000-maal potenter dan de benzamiden. De IC50 voor AG14361 is 29 nM in gepermeabiliseerde SW620-cellen en 14 nM in intacte SW620-cellen. Kristallografische analyse van AG14361 gebonden aan het katalytische domein van kippen-PARP-1 toont aan dat het tricyclische ringsysteem van AG14361 zich bevindt in een pocket bestaande uit de aminozuurresiduen Trp861, His862, Gly863, Tyr896, Phe897, Ala898, Lys903, Ser904, Tyr907 en Glu988. AG14361 vormt belangrijke waterstofbruggen met Ser904 en Gly863 en een water-gemedieerde waterstofbrug met Glu988. De door AG14361 geïnduceerde groeiremming wordt niet toegeschreven aan PARP-1-gerelateerde effecten, omdat maximale PARP-1-remming wordt waargenomen bij veel lagere concentraties (≤1 μM) dan de GI50. AG14361 bij 0,4 μM beïnvloedt de genexpressie of groei van kankercellen niet, maar het verhoogt de antiproliferatieve activiteit en remt het herstel van potentieel dodelijke γ-stralingsschade in LoVo-cellen met 73%. Bovendien verandert 0,4 μM AG14361 de genexpressie niet substantieel, zoals aangetoond door microarray-analyse. Een blootstelling van 17 uur van A549-cellen aan 0,4 μM AG14361 verandert de expressie van de 6800 genen niet. Hoewel 0,4 μM AG14361 de cellulaire PARP-1-activiteit met meer dan 85% remt, verandert het in essentie de genexpressie en celproliferatie niet, wat aangeeft dat de cellulaire effecten van deze lage concentratie van AG14361 specifiek zijn voor PARP-1-remming. Hogere, groeiremmende concentraties van AG14361 beïnvloeden de genexpressie, maar deze effecten zijn waarschijnlijk niet gerelateerd aan PARP-1-remming, omdat celproliferatie in PARP^-/^- en PARP-1⁺/⁺-cellen gelijk wordt beïnvloed. AG14361 wordt snel opgenomen in de bloedbaan en verdeeld naar de tumor en lever, met lagere concentraties gedetecteerd in de hersenen. De weefsel-tot-plasma concentratieverhouding geeft aan dat AG14361 in tumorweefsel wordt vastgehouden over tijd in beide xenograftmodellen, met tumorconcentraties (≥15 μM gedurende 2 uur) die de vereiste voor het remmen van PARP-1-activiteit in vitro overschrijden. [1] AG14361 verbetert de activiteit in alle MMR-competente cellen (1,5–3,3-voudig) maar is effectiever in MMR-deficiënte cellen (3,7–5,2-voudige potentiëring), waardoor resistentie wordt overwonnen. Daarentegen verhoogt benzylguanine de werkzaamheid alleen in MMR-competente cellen, maar is het ineffectief in MMR-deficiënte cellen. [2] AG14361 verbetert de groeiremmende en cytotoxische effecten van topoisomerase I-giften. AG14361 verhoogt de persistentie van camptothecine-geïnduceerde DNA-enkelstrengsbreuken. [3]

Behandeling met AG14361 vóór bestraling verhoogt statistisch significant de gevoeligheid voor radiotherapie van muizen met LoVo-xenografts. AG14361 verhoogt statistisch significant de bloedstroom in xenografts en verhoogt zo potentieel de medicijnafgifte aan tumorxenografts. In vivo verhogen niet-toxische doses AG14361 de vertraging van LoVo-xenograftgroei, geïnduceerd door röntgenstraling, met 2- tot 3-voudig. Gelijktijdige toediening van AG14361 verhoogt statistisch significant de activiteit tegen LoVo-xenografts, waarbij de tumorgroeivertraging wordt verhoogd van 3 dagen naar 9 dagen door AG14361 bij 5 mg/kg en naar 10 dagen door AG14361 bij 15 mg/kg. De combinatie van AG14361 veroorzaakt volledige regressie van SW620-xenografttumoren. PARP-1-activiteit, gedetecteerd door farmacodynamische analyse, in SW620-xenografts wordt met meer dan 75% geremd gedurende ten minste 4 uur na intraperitoneale toediening van AG14361 (10 mg/kg), consistent met de concentratie van AG14361 die in de tumor blijft bestaan. [1]

• PARP-1 Activiteitsassays

  De activiteit van full-length recombinant humaan PARP-1 wordt gemeten in een reactiemengsel dat 20 nM PARP-1, 500 μM NAD⁺ plus [³²P]NAD⁺ (0,1–0,3 μCi per reactiemengsel), en geactiveerd kalfs-thymus-DNA (10 μg/mL) bij 25^oC bevat; de reactie wordt na 4 minuten beëindigd door toevoeging van ijskoude 10% (gew./vol.) trichloorazijnzuur. Het reactieproduct [³²P]ADP-ribose, opgenomen in zuur-onoplosbaar materiaal, wordt afgezet op Whatman GF/C glasvezelfilters met een Bio-Dot microfiltratieapparaat en gekwantificeerd met een PhosphorImager. Remming van PARP-1-activiteit door AG14361 bij 0–600 nM wordt gemeten, en de K_i voor AG14361 wordt berekend door niet-lineaire regressieanalyse.

• Cellijnen

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells.

• Concentraties

  0-20 μM

• Incubatietijd

  5 days

• Methode

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells are maintained in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum. Cell growth inhibition is estimated in exponentially growing LoVo, A549, and SW620 cells in 96-well plates. Cells are exposed to AG14361 (0–20 μM) alone. After 5 days of culture, these cells are fixed with 10% trichloroacetic acid and stained with sulforhodamine B. The concentration of  AG14361 alone or in combination that inhibits growth by 50% (GI50) is calculated from computer-generated curves. Recovery from potentially lethal damage is measured in confluent LoVo cell cultures arrested in G1 phase to mimic the radiation-resistant quiescent cell population in tumors. Such cells are exposed to 8 Gy of γ-irradiation and then harvested and plated for colony formation assay immediately or maintained as growth-arrested confluent cultures for a 4-hour or 24-hour recovery period before harvesting and plating for the colony formation assay. Where indicated, 0.4 μM AG14361 is added 30 minutes before irradiation and is present in the recovery incubation.

• Dierlijke modellen

  SW620 or LoVo xenografts in CD-1 nude mice

• Doseringen

  5 or 15 mg/kg

• Toediening

  Treated intraperitoneally, once daily for 5 days