A-966492

A-966492 is een van de meest potente PARP-remmers. Deze verbinding vertoont uitstekende potentie tegen het PARP-1 enzym met een K_i van 1 nM en een EC50 van 1 nM in een helecel-assay. Het verhoogt significant de werkzaamheid van TMZ op een dosisafhankelijke manier. Bovendien is deze chemische stof oraal biologisch beschikbaar in meerdere species, passeert het de bloed-hersenbarrière en lijkt het zich te distribueren in tumorweefsel. Het vertegenwoordigt een veelbelovend, structureel divers benzimidazoolanalogon en wordt preklinisch verder gekarakteriseerd. [1]

A-966492 toont ook goede in vivo werkzaamheid in een B16F10 subcutaan murien melanoommodel in combinatie en in een MX-1 borstkanker xenograftmodel zowel als enkelvoudig middel als in combinatie. Bovendien heeft deze verbinding uitstekende farmaceutische eigenschappen en heeft het in vivo werkzaamheid aangetoond in preklinische muistumormodellen in combinatie met TMZ, evenals enkelvoudige middelactiviteit in een BRCA1-deficiënt MX-1 tumormodel. Het wordt verder gekarakteriseerd in Sprague-Dawley ratten, beaglehonden en cynomolgusapen, waarbij deze chemische stof orale biologische beschikbaarheid van 34-72% en halfwaardetijden van 1,7-1,9 uur vertoont. In vivo toont het een significante verbetering van de werkzaamheid van TMZ in een murien B16F10 syngene melanoommodel, waarbij de combinatiesuperieure werkzaamheid vertonen. [1]

• PARP Enzymassay

  De enzymassay wordt uitgevoerd in buffer die 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM dithiothreitol (DTT) en 4 mM MgCl₂ bevat. PARP-reacties bevatten 1,5 μM [³H]-NAD⁺ (1,6 μCi/mmol), 200 nM gebiotinyleerd histone H1, 200 nM slDNA en 1 nM PARP-1- of 4 nM PARP-2-enzym. Autoreacties die gebruik maken van SPA-bead-gebaseerde detectie worden uitgevoerd in volumes van 100 μL in witte 96-wells platen. Reacties worden geïnitieerd door 50 μL 2X NAD⁺ substraatmengsel toe te voegen aan 50 μL 2× enzymmengsel dat PARP en DNA bevat. Deze reacties worden beëindigd door toevoeging van 150 μL 1,5 mM benzamide (~1 × 10³-voudig over zijn IC50). Een hoeveelheid van 170 μL van de gestopte reactiemengsels wordt overgebracht naar streptavidine-gecoate Flash Plates, 1 uur geïncubeerd en geteld met een TopCount microplaat scintillantieteller. K_i-gegevens worden bepaald uit inhibitiecurven bij verschillende substraatconcentraties.

• Cellijnen

  C41 cell

• Concentraties

  ~10 nM

• Incubatietijd

  30 minutes

• Methode

  C41 cells are treated with A-966492 for 30 minutes in a 96-well plate. PARP are activated by damaging DNA with 1 mM H₂O₂ for 10 minutes. Cells are washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) once and fixed with prechilled methanol/acetone (7:3) at -20 °C for 10 minutes. After they are air-dried, plates are rehydrated with PBS and blocked using 5% nonfat dry milk in PBS-Tween(0.05%) (blocking solution) for 30 minutes at room temperature. Cells are incubated with anti-PAR antibody 10H (1:50) in blocking solution at room temperature for 60 minutes followed by washing with PBS-Tween20 five times, and incubation with goat antimouse 5(6)-isothiocyanate (FITC)-coupled antibody (1:50) and 1 μg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in blocking solution at room temperature for 60 minutes. After washing with PBS-Tween20 5 times, analysis is performed using an fmax Fluorescence Microplate Reader set at the excitation and emission wavelength for FITC or the excitation and emission wavelength for DAPI. PARP activity (FITC signal) is normalized with cell numbers (DAPI).

• Dierlijke modellen

  A 0.2 cc amount of a 1:10 dilution of tumor brei in 45% Matrigel and 45% Spinner MEM is injected subcutaneously into the flank of female SCID mice.

• Doseringen

  12.5, 25, and 50 mg/kg/day, for 14 days

• Toediening

  Orally administrated