PR-171 (Carfilzomib)

Carfilzomib (PR-171) remt de proliferatie in een verscheidenheid aan cellijnen en van patiënten afgeleide neoplastische cellen, waaronder multipel myeloom, en induceerde intrinsieke en extrinsieke apoptotische signaalroutes en activering van c-Jun-N-terminale kinase (JNK). Het onthult een verbeterde anti-MM-activiteit, overwint resistentie tegen andere middelen en werkt synergetisch met (Dex). Deze verbinding vertoont een preferentiële in vitro remmende potentie tegen de ChT-L-activiteit in de β5-subeenheid, met meer dan 80% remming bij doses van 10 nM. Korte blootstelling aan een lage dosis Carfilzomib leidt tot preferentiële bindingsspecificiteit voor het β5 constitutieve 20S proteasome en de β5i immunoproteasome-subeenheden. Meting van caspase-activiteit in ANBL-6-cellen gepulst ermee toont aanzienlijke stijgingen van caspase-8-, caspase-9- en caspase-3-activiteit na 8 uur, wat respectievelijk een 3,2-, 3,9- en 6,9-voudige toename oplevert ten opzichte van controlecellen na 8 uur. In met carfilzomib gepulseerde cellen is de mitochondriale membraanintegriteit gedaald tot 41% (Q1 + Q2), vergeleken met 75% in met vehikel behandelde controlecellen. [1] In een andere studie heeft het ook preklinische effectiviteit getoond tegen hematologische en solide maligniteiten. [2] Het remt direct de osteoclastenformatie en botresorptie. [3]

Carfilzomib (PR-171) vermindert de tumorgroei matig in een in vivo xenograftmodel. Het vermindert effectief de levensvatbaarheid van multipel myeloomcellen na continue of transiënte nabootsende behandeling. Deze verbinding verhoogt ook het trabeculair botvolume, vermindert botresorptie en verbetert de botvorming bij niet-tumor dragende muizen. [3]

• Enzyme-linked immunosorbent assay voor subeenheidsprofilering van carfilzomib

  ANBL-6-cellen (2 × 10⁶/well) worden geplateerd in 96-wells platen en gedurende 1 uur behandeld met Carfilzomib (PR-171) doses van 0,001 tot 10 μM. Cellen worden vervolgens gelyseerd (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA) en gezuiverde lysaten worden overgebracht naar polymeraseketenreactie (PCR) platen. Een standaardcurve wordt gegenereerd met onbehandelde ANBL-6-cellysaten, beginnend bij een concentratie van 6 μg eiwit/μL. De actieve-plaats-probe [biotin-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-epoxyketon; 20 μM] wordt toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Cellysaten worden vervolgens gedenatureerd door 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe te voegen en te verwarmen tot 100°C, gevolgd door menging met 20 μL per well streptavidine-sepharose high-performance parels in een 96-wells multiscreen DV-plaat en gedurende 1 uur geïncubeerd. Deze parels worden vervolgens gewassen met enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) buffer (PBS, 1% runderserumalbumine en 0,1% Tween-20) en 's nachts bij 4°C geïncubeerd op een plaatschudder met antilichamen tegen proteasome-subeenheden. Gebruikte antilichamen omvatten muismonoklonaal anti-β1, anti-β2, anti-β1i en anti-β5i, geit-polyklonaal anti-β2i en konijn-polyklonaal anti-β5 (affiniteit-gezuiverd antiserum tegen KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS-peptide). De parels worden gewassen en gedurende 2 uur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire geit-antikonijn, geit-antimuis of konijn-antigeit antilichamen. Na het wassen worden de parels ontwikkeld met behulp van het supersignal ELISA picochemiluminescentie substraat. Luminescente detectie wordt uitgevoerd. Ruwe luminescentie wordt omgezet naar μg/mL door vergelijking met de standaardcurve en uitgedrukt als de % remming ten opzichte van de voertuigcontrole. Curvefits worden gegenereerd met behulp van de volgende niet-sigmoïdale dosis-responsvergelijking: Y = Onderkant + (Bovenkant-Onderkant)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × HillSlope)), waarbij X het logaritme van de concentratie is, Y de % remming, en EC50 de dosis van deze verbinding die 50% effect vertoont.

• Cellijnen

  WST-1, ANBL-6 cells

• Concentraties

  100 nM

• Incubatietijd

  1 hour

• Methode

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Dierlijke modellen

  Beige-nude-XID mice

• Doseringen

  2.0 mg/kg

• Toediening

  i.v.