ZM 447439

In vitro remt ZM-447439 selectief recombinante humane Aurora A en B met IC50-waarden van respectievelijk 110 en 130 nM, terwijl andere proteïnekinasen van diverse structurele typen, waaronder de mitotische kinasen CDK1 en PLK1, worden geremd met IC50-waarden >10 μM. [1] Aurora kinase inhibitor, ZM-447439 remt tijds- en dosisafhankelijk de groei van alle drie de cellijnen met IC50-waarden van 3 μM (BON), 0.9 μM (QGP-1) en 3 μM (MIP-101) na 72 uur continue blootstelling. Bovendien induceert ZM-447439 potentieel celapoptose door DNA-fragmentatie en caspases 3 en 7-activering te bevorderen, en arresteert het GEP-NET-cellen in de G₀/G₁- en G₂/M-fase van de Cell Cycle. [2] In het muizenembryo resulteert remming van Aurora kinase-activiteit door ZM-447439 in afwijkingen tijdens mitose door de fosforylering van histon H3 serine 10 (H3S10Ph) van G2 tot metafase te reguleren met verschillende verstoringen in elke embryonale cyclus. [3] Een recente studie toont aan dat ZM-447439 een groeiremmend en pro-apoptotisch effect heeft op cervicale kanker SiHa-cellen, en de chemosensitiviteit verbetert. [4]

• In vitro kinase-assays

  Recombinant Aurora A en B worden uitgedrukt als NH₂-terminale His₆-getagde fusie-eiwitten met behulp van een baculovirus-expressiesysteem. Aurora A wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie met Ni-NTA-agarose, en Aurora B wordt gezuiverd door ionenuitwisselingschromatografie met CM Sepharose Fast Flow. 1 ng gezuiverd recombinant enzym wordt toegevoegd aan een reactiecocktail die 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM KCl, 2.5 mM NaF, 0.6 mM DTT, 6.25 mM MnCl₂, 10 μM peptidesubstraat, 10 μM voor Aurora A of 5 μM ATP voor Aurora B bevat, en 0.2 μCi γ-[³³P]ATP (specifieke activiteit ≥2,500 Ci/mmol), en wordt vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Reacties worden gestopt door toevoeging van 20% fosforzuur, en de producten worden op P30-nitrocellulosefilters opgevangen en geanalyseerd op inbouw van ³³P met een Betaplate^TM-teller. Geen enzym- en geen samengestelde controlewaarden worden gebruikt om de concentratie van ZM447439 te bepalen, die 50% remming van de enzymactiviteit gaf. Verdere details zijn op aanvraag verkrijgbaar bij Nicholas Keen.

• Cellijnen

  BON, QGP-1 and MIP-101 cells

• Concentraties

  0-5 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cell number is evaluated by crystal violet staining. In brief, cells in 96-well plates are fixed with 1% glutaraldehyde. Then cells are stained with 0.1% crystal violet. The unbound dye is removed by washing with water. Bound crystal violet is solubilized with 0.2% Triton X-100. Light extinction which increases linearly with the cell number is analyzed at 570 nm using an ELISA reader.