VX-809 (Lumacaftor)

Lumacaftor (VX-809) werkt op ER-niveau om een fractie van het F508del-CFTR in staat te stellen een correct gevouwen vorm aan te nemen, om het ER te verlaten en zich naar het celoppervlak te mobiliseren voor normaal functioneren. In Fischer-rattenschildkliercellen (FRT) die F508del-CFTR tot expressie brengen, verbetert deze verbindingbehandeling de F508del-CFTR-rijping aanzienlijk met 7,1 keer met een EC50 van 0,1 μM, en verbetert het F508del-CFTR-gemedieerde chloridetransport met ongeveer 5 keer met een EC50 van 0,5 μM, terwijl VRT-768 hogere EC50-waarden heeft van respectievelijk 7,9 μM en 16 μM. In HEK-293-cellen die F508del-CFTR tot expressie brengen, verhoogt het (3 μM) de uitgang van F508del-CFTR uit het ER met 6 keer, waardoor niveaus bereikt worden die vergelijkbaar zijn met 34% van CFTR. In primaire menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) met F508del-CFTR-mutatie, verhoogt het middel de CFTR-rijping en verbetert het de chloride secretie met een EC50 van respectievelijk 350 nM en 81 nM, werkzamer dan Corr-4a en VRT-325. F508del-CFTR gecorrigeerd door het vertoont een open waarschijnlijkheid van een enkel kanaal van 0,39, vergelijkbaar met normaal CFTR van 0,40. In tegenstelling tot VX-770 is het geen CFTR-potentiator, aangezien acute toevoeging geen effect heeft op de F508del-CFTR-functie. In tegenstelling tot VRT-325 en Corr-4a verbetert het de verwerking van de normale of mutante vormen van hERG of P-gp niet, evenals andere ziekteveroorzakende verkeerd gelokaliseerde eiwitten, waaronder α1-antitrypsine Z-mutant (E342K-α1-AT) of N370S-β-glucosidase, wat suggereert dat het specifiek is voor CFTR. Het in combinatie met VRT-325 of Corr-4a heeft een additief effect op CFTR-gemedieerd chloridetransport in gekweekte F508del-HBE. [1]

Lumacaftor (VX-809; VRT 826809) is een CFTR-modulator die de vouwing en het transport van CFTR-eiwit corrigeert.

• F508del-CFTR rijping

  FRT-cellen die stabiel F508del-CFTR tot expressie brengen, worden gedurende 48 uur behandeld met toenemende concentraties Lumacaftor (VX-809). Na incubatie worden de cellen geoogst in ijskoude D-PBS-oplossing (zonder calcium en magnesium) en gecentrifugeerd bij 1.000 × g bij 4 °C. Celpellets worden gedurende 30 minuten op ijs gelyseerd in 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 200 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8 en 1 mM EDTA plus proteaseremmer (1:250). Lysaten worden gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 10.000 × g bij 4 °C om kernen en onoplosbaar materiaal af te pelletten. Ongeveer 12 g totaal eiwit wordt gedurende 5 minuten bij 37 °C verwarmd in Laemmli-buffer met 5% -mercapto-ethanol en geladen op een 3% tot 8% Tris-acetaatgel. De gel wordt overgebracht naar nitrocellulose en verwerkt voor Western blotting met behulp van monoklonale CFTR-antilichaam of polyklonaal naar GAPDH. Blotten worden ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie. Kwantificering van de relatieve hoeveelheden banden C en GAPDH wordt uitgevoerd met behulp van NIH ImageJ-analyse van gescande films.

• Cellijnen

  FRT (CFTR or F508del-CFTR), HEK-293 (CFTT or F508del-CFTR) , and HBE cells

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~0.1 mM

• Incubatietijd

  24 or 48 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Lumacaftor (VX-809) for 24 or 48 hours. Ussing chamber techniques are used to record the transepithelial current (I_T) resulting from CFTR-mediated chloride transport. The single-channel activity of CFTR is measured by using excised inside-out membrane patch recordings. Immunoblot techniques using the monoclonal CFTR antibody are used to measure CFTR maturation in FRT, HEK-293, or HBE cells expressing CFTR or F508del-CFTR.

• Dierlijke modellen

  Male Sprague– Dawley rats

• Doseringen

  1 mg/kg

• Toediening

  p.o.