OSI-027

OSI-027 vertoont selectieve en ATP-competitieve remmende activiteiten tegen mTORC1 en mTORC2 met respectievelijk IC50 van 22 nM en 65 nM. Bovendien remt deze verbinding de mTOR-signalering van gefosforyleerd 4E-BP1 met een IC50 van 1 R M in celgebaseerde assays. [1] Het vertoont antiproliferatieve activiteiten tegen verschillende acute leukemie-cellijnen van myeloïde/megakaryocytaire oorsprong op een dosisafhankelijke manier, waaronder U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 en MEG-01 cellen. [2] Een recente studie toont aan dat remming van mTORC1/2 door deze chemische stof effectief de fosforylering van Akt (S473) en celproliferatie in borstkankercellen onderdrukt. [3]

In GEO colorectaal xenograft remt OSI-027 (65 mg/kg) zowel mTORC1- als mTORC2-effectoren, inclusief 4E-BP1, Akt en S6-fosforylering. Bovendien remt de gecombineerde remming van mTORC1 en mTORC2 door deze verbinding de tumorgroei krachtiger dan de mTORC1-remming door rapamycine. [1]

• Biochemische assays

  mTORC1- en mTORC2-remming wordt getest met behulp van natief enzymcomplex, geïmmunoprecipiteerd uit HeLa-lysaten bij 1 mM ATP. Om hele cellysaten van HeLa-cellen te bereiden, wordt 25 g celpellet gedurende 30 minuten in 60 mL ijskoude buffer A [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfaat, 10 mM glycerofosfaat, 50 mM NaF, 0,5 mM orthovanadaat en EDTA-vrije protease-remmers met 0,3% CHAPS] op een magnetische roerder in een koelcel gelyseerd. Na het klaren van de lysaten door centrifugatie bij 13.000 g gedurende 10 minuten, worden met proteïne G gecoate 384-wells platen geïncubeerd met 0,25 R g mTOR-antilichaam in 15 R L buffer A gedurende 1 uur bij 4 R C. Aan elke put wordt 40 R g HeLa-celysaat in 15 R L buffer A toegevoegd en 's nachts bij 4 R C geïncubeerd om mTOR-complexen te immunoprecipiteren. Platen worden 3 keer gewassen met buffer A en twee keer met immunoprecipitatie-wasbuffer [Buffer B: 50 mM HEPES (pH 7,5) en 150 mM NaCl]. OSI-027 wordt in een concentratie van 10 R M aan elke put toegevoegd en DMSO wordt aan de controleputten toegevoegd. De reactie wordt gestart door 150 ng His-getagd 4E-BP1 als substraat toe te voegen in aanwezigheid of afwezigheid van 100 R M ATP aan elke put in 25 R L vers bereide kinasebuffer [Buffer C: 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM R -mercapto-ethanol en 200 R M vanadaat] en 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) geïncubeerd. De reactie wordt gestopt door 25 R L reactiemengsel van elke put naar corresponderende putten van verse, met Ni-chelaat gecoate platen over te brengen en 's nachts bij 4 R C gevolgd door 2 uur bij 37 R C geïncubeerd. Om fosforylering van 4E-BP1 te detecteren, worden de platen eenmaal gewassen met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20) met 5% magere melkpoeder. Aan elke put wordt 25 R L 1:1.000 verdunde gefosforyleerde 4E-BP1-antilichamen in TBST met 5% magere melk toegevoegd en 1 uur bij RT geïncubeerd. De platen worden eenmaal gewassen met TBST en vervolgens wordt 25 R L anti-konijn HRP (1:10.000 verdund) in TBST met 5% magere melk toegevoegd. De platen worden 1 uur bij RT geïncubeerd en 5 keer gewassen met TBST. Voor de detectie van gefosforyleerd 4E-BP1 wordt 25 R L chemiluminescentiereagens A+B toegevoegd en de chemiluminescentie wordt gemeten met een Analyst-plaatlezer.

• Cellijnen

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Concentraties

  0-10 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Dierlijke modellen

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Doseringen

  ≤65 mg/kg

• Toediening

  Administered via gavage.