KU-0063794

In vergelijking met de mTOR-remmer PP242 vertoont KU-0063794 een hogere specificiteit voor mTOR, aangezien het inactief is tegen PI3K's of 76 andere kinasen. In HEK-293-cellen is 30 nM van deze verbinding voldoende om de S6K1-activiteit snel te ableren door de fosforylering van het hydrofobe motief (Thr³⁸⁹) en vervolgens de fosforylering van het T-lusresidu (Thr²²⁹) te blokkeren. In het geval van IGF1-stimulatie van serum-uitgehongerde HEK-293-cellen is 300 nM van deze verbinding nodig om de S6K1-activiteit met ~90% te remmen. Deze chemische stof bij 100-300 nM remt ook volledig de aminozuur-geïnduceerde fosforylering van S6K1 en S6-eiwit. Net als S6K1 remt het de fosforylering van mTORC1 bij Ser²⁴⁴⁸ en mTORC2 bij Ser²⁴⁸¹ op een dosisafhankelijke en tijdsafhankelijke manier. In aanwezigheid van serum of na IGF1-stimulatie induceert deze verbinding een dosisafhankelijke remming van de activiteit en fosforylering van Akt bij Ser⁴⁷³ en onverwachte Thr³⁰⁸, evenals de fosforylering van de Akt-substraten PRAS40 bij Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β bij Ser²¹/Ser⁹ en Foxo-1/3a bij Thr²⁴/Thr³². Deze verbinding, maar niet rapamycine, remt de SGK1-activiteit en Ser⁴²²-fosforylering, evenals het fysiologische substraat NDGR1 op een dosisafhankelijke manier, in dezelfde mate als S6K1- en Akt-fosforylering, terwijl het de door forbolester geïnduceerde ERK- of RSK-fosforylering en RSK-activering niet remt. Vergeleken met rapamycine vertoont deze chemische stof een significantere potentie om de volledige defosforylering van 4E-BP1 bij Thr³⁷, Thr⁴⁶ en Ser⁶⁵ te induceren. Het remt de celgroei van zowel wild-type als mLST8-deficiënte MEF's en induceert een G1-celcyclusarrest, significant meer dan rapamycine. [1]

Ku0063794 remt tumorgroei en mTOR-signalering in een preklinisch model voor niercelcarcinoom. Deze verbinding was echter niet effectiever in de dierstudie. Een mogelijke verklaring voor het gebrek aan grotere activiteit in vivo voor deze chemische stof[2].

• mTOR-complexen kinase-assays

  HEK-293-cellen worden vers gelyseerd in Hepes-lysisbuffer. Lysaat (1-4 mg) wordt voorgezuiverd door incubatie met 5-20 μL Protein G-Sepharose geconjugeerd aan pre-immuun IgG. De lysaat-extracten worden vervolgens geïncubeerd met 5-20 μL Protein G-Sepharose geconjugeerd aan 5-20 μg van ofwel anti-Rictor of anti-Raptor antilichaam, of pre-immuun IgG. Alle antilichamen zijn covalent geconjugeerd aan Protein G-Sepharose. Immunoprecipitaties worden gedurende 1 uur bij 4 °C uitgevoerd op een trillend platform. De immunoprecipitaten worden vier keer gewassen met Hepes-lysisbuffer, gevolgd door twee wasbeurten met Hepes-kinasebuffer. Voor Raptor-immunoprecipitaten die worden gebruikt voor het fosforyleren van S6K1, bevat de buffer voor de eerste twee wasstappen 0,5 M NaCl om optimale kinase-activiteit te garanderen. GST-Akt1 wordt geïsoleerd uit serum-gedepriveerde HEK-293-cellen geïncubeerd met PI-103 (1 μM gedurende 1 uur). GST-S6K1 wordt gezuiverd uit serum-gedepriveerde HEK-293-cellen geïncubeerd met rapamycine (0,1 μM gedurende 1 uur). mTOR-reacties worden geïnitieerd door toevoeging van 0,1 mM ATP en 10 mM MgCl₂ in aanwezigheid van verschillende concentraties KU-0063794 en GST-Akt1 (0,5 μg) of GST-S6K1 (0,5 μg). De reacties worden gedurende 30 minuten bij 30 °C uitgevoerd op een trillend platform en gestopt door toevoeging van SDS-monsterbuffer. Reactiemengsels worden vervolgens gefilterd door een 0,22-μm-poresize Spin-X-filter en monsters worden onderworpen aan elektroforese en immunoblot-analyse met de aangegeven antilichamen.

• Cellijnen

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• Incubatietijd

  24, 48, and 72 hours

• Methode

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• Dierlijke modellen

  Nu/Nu nude mice

• Doseringen

  8 mg/kg

• Toediening

  i.p.