Dubermatinib(TP-0903)

Dans les cellules de cancer du pancréas (PSN-1), le Dubermatinib (TP-0903) montre une forte activité antiproliférative avec une IC50 de 6 M. Il induit également un fort arrêt en G2/M en inhibant puissamment Aurora A et B. [1] Dans les cellules B de la LLC de tous les patients atteints de LLC, ce composé provoque une induction dose-dépendante d'une apoptose massive en ciblant l'Axl phosphorylée, et surmonte la protection des cellules B de la LLC contre l'apoptose médiatisée par le BMSC de la LLC. [2]

Dans l'hippocampe de rat adulte, l'administration intracérébroventriculaire de Dubermatinib (TP-0903) (2,5 nM) augmente significativement le nombre de cellules nouvellement générées et prolonge la survie des cellules hippocampiques. [3] Chez la souris, ce composé (20 μg/g, i.p.) prévient efficacement les anomalies de développement cérébelleux néonatal induites par les GC. [4]

• Test d'activité de l'Axl Kinase

  Les composés à tester sont dilués aux concentrations désirées dans un tampon de réaction de kinase (50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl², 1 mM EGTA, 2 mM DTT et 0,01% v/v Tween-20) et sont brièvement incubés avec l'Axl kinase. L'Axl kinase utilisée est l'Axl kinase humaine recombinante (domaine catalytique, acides aminés 473-894) avec un tag histidine. La réaction est initiée par l'ajout d'ATP et d'un substrat poly-GT marqué (poly Glu:Tyr, polymère 4:1). Les concentrations des différents composants dans le test (volume de réaction de 10 µL) sont : 1% DMSO, 93 ng/mL Axl kinase, 20 µM ATP et 200 nM de substrat poly-GT. Après l'ajout d'ATP et du substrat poly-GT, l'incubation est de 60 min à température ambiante, la réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 10 µL d'anticorps anti-phosphotyrosine PY20 marqué au terbium dans un tampon contenant de l'EDTA. La concentration finale d'EDTA et d'anticorps après ajout à la réaction est respectivement de 10 mM et 2 nM. L'anticorps conjugué au terbium génère un signal FRET résolu dans le temps avec la molécule (liée au substrat poly-GT) lorsque le substrat est phosphorylé. Après une heure d'incubation à température ambiante, la fluorescence est mesurée avec une excitation de 320 nm et une double émission de 495 et 520 nm sur un lecteur de microplaques EnVision. Le signal est exprimé en termes de rapport TR-FRET (intensité de fluorescence à 520 nm sur 495 nm).

• Lignées cellulaires

  PSN-1 cells

• Concentrations

  --

• Temps dincubation

  96 hours

• Méthode

  For cell proliferation assays with Dubermatinib(TP-0903), 45 µL containing 1000 cells per well are seeded into solid white 384-well plates in appropriate cell growth media containing 10% FBS and incubated overnight at 37 °C and 5% CO₂. The following day, this compound is diluted in serum free growth media to 10x desired concentrations and 5 µL is added to each well. Combined compound and cells are incubated for 96 hours. Following incubation, 40 µL of ATP-Lite solution is added to each well, incubated for an additional 10 minutes at room temperature and luminescence is measured on an EnVision microplate reader. Percent cell viability for it is calculated by comparing treated wells to appropriate controls (e.g. vehicle treated) included on each plate.