Tanespimycin (17-AAG)

Tanespimycin (17-AAG), een analoog van geldanamycine, vertoont een meer dan 100 keer hogere bindingsaffiniteit voor Hsp90 afgeleid van HER-2-overexpressieve kankercellen (BT474, N87, SKOV3 en SKBR3) of BT474 borstcarcinoomcellen met IC50-waarden van 5-6 nM. [1] Deze verbinding veroorzaakt de afbraak van HER2, HER3, Akt en zowel mutante als wild-type androgeenreceptor (AR), wat leidt tot de RB-afhankelijke G1-groeiarrestatie van prostaatkankercellen zoals LNCaP, LAPC-4, DU-145 en PC-3 met IC50-waarden van 25-45 nM. [2] Naast het induceren van apoptosis van Ba/F3-cellen getransformeerd met wild-type BCR-ABL met een IC50 van 5,2 M, heeft het het vermogen om apoptosis van cellen getransformeerd met T315I en E255K BCR-ABL-mutanten te induceren met IC50-waarden van respectievelijk 2,3 M en 1,0 M, door de afbraak van zowel wild-type BCR-ABL-eiwit als mutanten te induceren. [3]

Tanespimycin (17-AAG) vertoont een significant hogere bindingsaffiniteit voor Hsp90 van 3T3-src-, B16- of CT26-xenografts bij naakte muizen met IC50-waarden van 8-35 nM, vergeleken met die van normale weefsels met IC50-waarden van 200-600 nM. [1] Toediening van deze verbinding (~50 mg/kg) veroorzaakt een significante daling van de AR-, HER2-, HER3- en Akt-expressie op een dosisafhankelijke manier met >50% daling bij een dosis van 50 mg/kg, wat resulteert in de dosisafhankelijke remming van androgeenafhankelijke (CWR22) en -onafhankelijke (CWR22R en CWRSA6) prostaatkanker-xenografts-groei met respectievelijk 67%, 80% en 68% bij een dosis van 50 mg/kg. [2]

• Hsp90-bindingsassays

  Gezuiverd natief Hsp90-eiwit of cellelysaat van HER-2-overexpressieve kankercellen (BT474, N87, SKOV3 en SKBR3) of BT474 borstcarcinoomcellen in lysisbuffer (20 mM HEPES, pH 7,3, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 100 mM KCl) worden gedurende 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd met verschillende concentraties Tanespimycin (17-AAG) en vervolgens gedurende 1 uur bij 4 °C geïncubeerd met biotine-GM gekoppeld aan BioMag streptavidine magnetische kralen. Buizen worden op een magnetisch rek geplaatst en het ongebonden supernatant wordt verwijderd. De magnetische kralen worden driemaal gewassen in lysisbuffer en gedurende 5 minuten bij 95 °C verwarmd in SDS-PAGE-monsterbuffer. Monsters worden geanalyseerd op SDS-proteïnegels en western blots worden uitgevoerd met behulp van de aangegeven antilichamen. Banden in de western blots worden gekwantificeerd met behulp van de Bio-rad Fluor-S MultiImager en de percentage-inhibitie van de binding van Hsp90 aan de biotine-GM wordt berekend. De gerapporteerde IC50 is de concentratie van deze verbinding die nodig is om een half-maximale inhibitie van de binding te veroorzaken.

• Cellijnen

  BT474, SKBR3, N87, SKOV3, MCF7, MDA468, Hs578T, Hs578Bst, A549, HT29, U87, SKMG3, HT1080, RPTEC, NDF, HMVEC, HMEC, HUVEC, and PBMC cells

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Incubatietijd

  5 days

• Methode

  Cells are seeded in 96-well plates at 2,000 cells per well in a final culture volume of 100 μL for 24 hours before the addition of increasing concentrations of Tanespimycin (17-AAG), which is incubated for 5 days. Viable cell number is determined using the Celltiter 96 AQueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay. The value of the background absorbance at 490 nm (A₄₉₀) of wells not containing cells is subtracted. Percentage of viable cells = (A₄₉₀ of this compound treated sample/A₄₉₀ untreated cells) × 100. The IC50 is defined as the concentration that gave rise to 50% viable cell number.

• Dierlijke modellen

  Male nu/nu athymic mice inoculated s.c. with androgen-dependent CWR22 xenograft, and female nu/nu athymic mice inoculated s.c. with androgen-independent xenografts CWR22R and CWRSA6

• Doseringen

  ~50 mg/kg

• Toediening

  Injection i.p.