EPZ004777

EPZ004777 wordt 3-voudig verdund in DMSO voor een totaal van tien concentraties, beginnend bij 1 mM. Een aliquot van 1 μL van elke remmerverdunning wordt geplaatst in een 384-wells microtiterplaat. De 100% remmingscontrole bestond uit 2,5 mM eindconcentratie van de productremmer S-adenosyl-L-homocysteïne (SAH). Deze verbinding wordt 30 min geïncubeerd met 40 ml per putje van 0,25 nM DOT1L(1-416) in assaybuffer (20 mM TRIS [pH 8.0] 10 mM NaCl, 0,002% Tween 20, 0,005% runderhuidgelatine, 100 mM KCl en 0,5 mM DTT). 10 ml per putje substraatmengsel bestaande uit assaybuffer met 200 nM ³H-SAM (American Radiolabeled Chemicals: 80 Ci/mmol), 600 nM ongelabeld SAM en 20 nM nucleosomen worden toegevoegd om de reactie te initiëren (beide substraten zijn aanwezig in het uiteindelijke reactiemengsel bij hun respectieve KM-waarden). Reacties worden 120 min geïncubeerd en geblust met 10 ml per putje van 800 mM SAM. De incorporatie van radioactiviteit in nucleosoomsubstraat wordt gemeten in een flashplate. IC50-waarden voor enzymen in het Histone Methyltransferase-paneel worden bepaald onder vergelijkbare gebalanceerde assaycondities met zowel SAM als eiwit/peptide substraat aanwezig in concentraties gelijk aan hun respectieve KM-waarden.

Human leukemia cell lines MV4-11, THP-1, RS4;11, Kasumi-1, HL-60, REH, and Jurkat. SEM, KOPN-8, 697, U937 and MOLM-13 cells.

~50 μM

14-18 days

For assessment of cell proliferation and viability in human cell lines, exponentially growing cells are plated, in triplicate, in 96-well plates in a final volume of 150 ml. Cells are incubated in the presence of 3 μM (proliferation curve), or increasing concentrations (IC50 determination) of EPZ004777 up to 50 μM. Viable cell number is determined every 3–4 days for up to 18 days using the Guava Viacount assay and analyzed on a Guava EasyCyte Plus instrument according to the manufacturer’s protocol. On days of cell counts, growth media and this compound are replaced and cells split back to a density of 5×10⁴ cells/well. Total cell number is expressed as split-adjusted viable cells per well. For each cell line, IC50 values are determined from concentration-dependence curves at each time point using Graphpad Prism software. Experiments to determine IC50 values continues until IC50 values stabilized (day 18 for THP-1 cells, day 14 for all other cell lines). For assessment of the effect of this compound treatment on transformed murine hematopoietic progenitors, cells from two independent transductions for each virus are plated in 24-well plates at a density of 0.5–1×10⁵ cell/well in 1 ml media in 24-well plates and exposed to increasing concentrations of this chemical up to 30 mM. Cells are counted and replated at equal cell numbers in fresh media with fresh compound every 3–4 days. For MTT assays, cells from serial replatings are harvested on day 10 and plated, in triplicate at 2×10⁴ cells/well in 100 ml media with the appropriate concentration of this compound. Cells are incubated for 2.5 days, the exposed to 10 ml MTT reagent for 3 hr, and lysed over night in 100 ml MTT- solubilization buffer (both from Cell Proliferation Kit I [MTT]).

A mouse xenograft MV4-11 model of MLL.

Mini-pumps containing 100 and 150 mg/mL EPZ004777 solutions

Osmotic pump