Tivantinib

Van ARQ-197 is aangetoond dat het HGF/c-Met-geïnduceerde cellulaire responsen in vitro voorkomt. Deze verbinding bezit antitumoractiviteit; het remt de proliferatie van A549-, DBTRG- en NCI-H441-cellen met een IC50 van 0,38, 0,45, 0,29 μM. Behandeling met dit middel resulteert in een afname van de fosforylering van de MAPK-signaalcascade en preventie van invasie en migratie. Bovendien zorgt ectopische expressie van c-Met in NCI-H661, een cellijn zonder endogene expressie van c-Met, ervoor dat het een invasief fenotype krijgt dat ook door deze chemische stof wordt onderdrukt. Hoewel de toevoeging van toenemende concentraties van deze remmer de K_m van ATP niet significant beïnvloedt, verminderde blootstelling van c-Met aan 0,5 μM van deze substantie de V_max van c-Met met ongeveer 3-voudig. Het vermogen van dit molecuul om de V_max te verlagen zonder de Km van ATP te beïnvloeden, bevestigde dat het c-Met remt via een niet-ATP-competitief mechanisme en kan daarom verantwoordelijk zijn voor de hoge mate van kinase-selectiviteit. Het voorkomt humaan recombinant c-Met met een berekende remmende constante K_i van ongeveer 355 nM. Hoewel de hoogste concentratie ATP die werd gebruikt 200 μM is, wordt de potentie van deze verbinding tegen c-Met niet verminderd door ATP-concentraties tot 1 mM te gebruiken. Het blokkeert c-Met-fosforylering en stroomafwaartse c-Met-signaalroutes. Deze chemische stof onderdrukt constitutieve en ligand-gemedieerde c-Met-autofosforylering en, bij uitbreiding, c-Met-activiteit, wat op zijn beurt leidt tot de remming van stroomafwaartse c-Met-effectoren. De inductie van caspase-afhankelijke Apoptosis related is verhoogd in c-Met-expresserende menselijke kankercellen, waaronder HT29-, MKN-45- en MDA-MB-231-cellen.[1][2]

Alle drie de xenograftmodellen die met Tivantinib werden behandeld, vertonen een vermindering van de tumorgroei: 66% in het HT29-model, 45% in het MKN-45-model en 79% in het MDA-MB-231-model. In deze xenograftstudies werden geen significante veranderingen in lichaamsgewicht waargenomen na orale toediening van deze verbinding bij 200 mg/kg. Farmacodynamisch wordt de fosforylering van c-Met in humane colon-xenografttumoren (HT29) sterk geremd door deze chemische stof, zoals beoordeeld door een dramatische vermindering van c-Met-autofosforylering 24 uur na een enkele orale dosis van 200 mg/kg van dit middel. Dezelfde dosering bij muizen toont aan dat tumorxenografts worden blootgesteld aan aanhoudende plasmaconcentraties van de verbinding, consistent met de waargenomen farmacodynamische remming van c-Met-fosforylering en remming van proliferatie van c-Met-bevattende kankercellijnen. Plasmaspiegels van het middel 10 uur na dosering werden bepaald op 1,3 μM, meer dan 3-voudig boven de biochemische remmende constante van deze substantie voor c-Met. Daarom is het in staat om zijn doelwit in vivo in het xenogefted menselijk tumorweefsel te onderdrukken. Concluderend, deze remmer blokkeert de groei van c-Met-afhankelijke xenogefted menselijke tumoren.[1]

• c-Met SDS-PAGE in vitro kinase-assay

  Recombinant c-Met-eiwit (100 ng) wordt 30 minuten bij kamertemperatuur gepreïncubeerd met toenemende concentraties van deze verbinding. Na preïncubatie worden 100 μM poly-Glu-Tyr-substraat en verschillende concentraties ATP met 5 μCi [γ-32P]ATP aan het reactiemengsel toegevoegd. De reactie wordt 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens gestopt door toevoeging van 5 μL SDS-polyacrylamidegel, met reducerende monsterbuffer. De monsters worden vervolgens op een 7,5% acrylamidegel geladen en SDS-PAGE wordt uitgevoerd. De gefosforyleerde poly-Glu-Tyr-substraten worden uiteindelijk gevisualiseerd door autoradiografie. c-Met-activiteit wordt gekwantificeerd door densitometrie.

• Cellijnen

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Concentraties

  0.03-10 μM

• Incubatietijd

  24, 32, and 48 hours

• Methode

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Dierlijke modellen

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Doseringen

  200 mg/kg

• Toediening

  Orally administered