A-769662

A-769662 stimuleert gedeeltelijk gezuiverd rattenlever AMPK met EC50 van 0,8 μM. Deze verbinding activeert AMPK gezuiverd uit meerdere weefsels en soorten op een dosis-responsieve manier met bescheiden variaties in waargenomen EC50's. EC50's bepaald voor deze chemische stof met behulp van gedeeltelijk gezuiverde AMPK-extracten van rattenhart, ratten spieren of menselijke embryonale niercellen (HEK's) zijn respectievelijk 2,2 mM, 1,9 mM of 1,1 mM. Een behandeling van 4 uur van primaire rattenhepatocyten met deze verbinding verhoogt dosisafhankelijk de ACC-fosforylatie, wat correleerde met remming van vetzuursynthese met IC50 van 3,2 μM. Het remt ook de vetzuursynthese in muizenhepatocyten met IC50 van 3,6 μM [1] Deze verbinding activeert AMPK zowel allosterisch als door defosforylatie van AMPK op Thr-172 te remmen, vergelijkbaar met de effecten van AMP. [2] Het remt de proteasomale functie via een AMPK-onafhankelijk mechanisme. Deze chemische stof beïnvloedt de in vitro activiteit van gezuiverde 26S proteasomen, maar niet de in vitro activiteit van gezuiverde 20S proteasomen. Het heeft toxische effecten op MEF-cellen. [3] Recent onderzoek toont aan dat deze verbinding celproliferatie en DNA-synthese remde. [4]

Kortdurende behandeling van normale Sprague Dawley-ratten met A-769662 verlaagt de malonyl-CoA-niveaus in de lever en de respiratoire uitwisselingsverhouding, VCO2/VO2, wat duidt op een verhoogde snelheid van de vetzuuroxidatie van het hele lichaam. Behandeling van ob/ob-muizen met 30 mg/kg tweemaal daags van deze verbinding verlaagt de hepatische expressie van PEPCK, G6Pase en FAS, verlaagt de plasmaglucose met 40%, vermindert de gewichtstoename en vermindert significant zowel de plasma- als de levertriglycerideniveaus. [1]

• 96-well AMPK assay

  AMPK-activiteit wordt gemeten door de fosforylering van het SAMS-peptidesubstraat (20 μM in standaard assays en 100 μM in additiviteitsassays) te controleren volgens een eerder beschreven protocol (Anderson et al., 2004). Om te bepalen of A-769662-geïnduceerde AMPK-activering op een omkeerbare manier plaatsvindt, worden AMP of deze verbinding voorgeïncubeerd met rattenlever-AMPK gedurende 10 minuten bij 20 keer de standaard assayconcentraties voorafgaand aan verdunning en meting van AMPK-activiteit.

  [1]

• Cellijnen

  MEF cells

• Concentraties

  300 μM

• Incubatietijd

  24 hours

• Methode

  Cell viability of MEF cells treated or not with A-769662 is performed as follows: cells are harvested by trypsinization and incubated with 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine at room temperature in the dark; cell viability is analyzed by flow cytometry using a FACScanto flow cytometer, using an excitation laser at 488 nm and a propidium iodine fluorescence detection at 600 nm. To determine the proportion of cells in each phase of the cell cycle, cells are harvested by trypsinization, collected by centrifugation, washed in PBS and fixed overnight in 80% ethanol at -20 °C. Subsequently, these fixed cells are centrifuged to remove the fixative and incubated for 20 minutes in the dark at room temperature in PBS containing 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine. Flow cytometry analysis is performed as above. The proportion of cells in G1, S, and G2 is determined using the MODFIT program. Cell culture pictures are taken at the indicated times using a camera coupled to an inverted microscope with a 20 × objective.

• Dierlijke modellen

  Sprague Dawley rats

• Doseringen

  30 mg/kg

• Toediening

  Administered via i.p.